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編者按：
紅果寶公司委托愛爾蘭國立都柏林大學(xué)等國內(nèi)外相關(guān)科研團(tuán)隊(duì)，歷經(jīng)三年，以山楂紅素為原料，在山楂紅素超分子構(gòu)效機(jī)制的聯(lián)合攻關(guān)研究中取得重大進(jìn)展?，F(xiàn)摘要轉(zhuǎn)發(fā)《國際生物大分子雜志》期刊上發(fā)表的學(xué)術(shù)研究論文《山楂提取物納米顆?？稍鰪?qiáng)細(xì)胞對游離多酚吸收》一文主要內(nèi)容，以饗讀者。
本研究首次發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過組合式熱加工處理后，山楂中的多酚和黃酮等植物活性/藥用成分可自發(fā)組裝形成納米級(jí)多酚復(fù)合結(jié)構(gòu)，命名為“山楂紅素納米顆粒”。通過非靶向與靶向代謝組學(xué)質(zhì)譜技術(shù)，初步解析了多酚與納米顆粒骨架間的化學(xué)作用機(jī)制。這類納米結(jié)構(gòu)不僅有助于提升多酚穩(wěn)定性，還能通過內(nèi)吞等機(jī)制增強(qiáng)其在腸道中的吸收效率，從而為“中藥炮制”促進(jìn)藥效提供了分子結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，拓展了中藥 “成分—結(jié)構(gòu)—功能”協(xié)同作用的現(xiàn)代科學(xué)解釋。此外，當(dāng)前市售功能性保健品及部分中藥制劑中多采用乙醇等有機(jī)溶劑提取純化得到游離多酚，雖廣為使用但生物利用度較低，腸道吸收效率有限。如何提升活性成分在腸道中的穩(wěn)定性與遞送效率，是功能食品與中藥現(xiàn)代化的重要課題。 本研究揭示了山楂紅素納米顆粒(膠體態(tài))與游離多酚(分子態(tài))在遞送和腸道吸收機(jī)制上的顯著差異，以及納米結(jié)構(gòu)在提升生物利用度方面的關(guān)鍵作用，為探究山楂紅素等典型食藥同源產(chǎn)品的吸收機(jī)制提供了新的理論依據(jù)與創(chuàng)新思路。
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在后疫情時(shí)代，全球?qū)δ苄允称返男枨蠹ぴ觯?ldquo;食品優(yōu)先戰(zhàn)略”逐漸獲得廣泛支持，強(qiáng)調(diào)通過健康食物和全面營養(yǎng)來預(yù)防干預(yù)疾病并減少對藥物依賴。山楂(Crataegus spp.)作為“食藥同源”理念的典型代表，因其富含綠原酸、咖啡酸、槲皮素等多酚類化合物，展現(xiàn)出顯著的抗炎、調(diào)脂和助消化等多種生物活性。經(jīng)過傳統(tǒng)加工如炒制，山楂的藥用價(jià)值進(jìn)一步提升，展現(xiàn)出調(diào)節(jié)血脂、改善胃腸功能和抗炎等作用，并得到了廣泛的臨床試驗(yàn)證實(shí)。然而，盡管已有大量證據(jù)表明多酚對健康有益，其游離狀態(tài)下的低生物利用度仍是其效果充分發(fā)揮的瓶頸，同時(shí)這也使得它們難以完全解釋山楂作為中藥的整體療效。
值得注意的是，食物或草藥中的多酚類物質(zhì)通常不會(huì)以單一形式存在，而是通過自組裝形成微納米結(jié)構(gòu)，這些結(jié)構(gòu)通過多酚的多羥基和苯環(huán)結(jié)構(gòu)形成的相互作用力(如π-π堆積、氫鍵)驅(qū)動(dòng)。此外，多酚還可能與草藥基質(zhì)中的其他成分(如多糖、蛋白質(zhì)等)發(fā)生相互作用，這些相互作用可能影響其穩(wěn)定性和生物利用度。然而，這些相互作用的具體機(jī)制，特別是在熱加工條件下對多酚生物利用度的影響，尚未得到系統(tǒng)性研究。
近年來，隨著對中藥傳統(tǒng)加工過程中活性成分結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化的關(guān)注增加，研究認(rèn)為，這些加工過程可能伴隨成分的遞送潛力增強(qiáng)，提升藥效的傳統(tǒng)經(jīng)驗(yàn)亟待通過現(xiàn)代科學(xué)手段加以驗(yàn)證。事實(shí)上，基于植物外泌體的納米遞送系統(tǒng)因其優(yōu)異的穩(wěn)定性與靶向性，已成為提升中藥活性成分吸收的研究熱點(diǎn)。然而，相較之下，對于中藥傳統(tǒng)加工過程中所形成的納米顆粒，尤其是炒制和煎煮等工藝中生成的結(jié)構(gòu)，其成分和作用機(jī)制尚未被充分認(rèn)識(shí)。草藥中的活性成分通常被細(xì)胞膜包裹，難以直接被吸收。為了解決這一問題，傳統(tǒng)中醫(yī)通過數(shù)千年的發(fā)展，已經(jīng)形成了多種炮制與煎煮方法，使草藥中的成分在高溫作用下與水或其他成分發(fā)生物理化學(xué)反應(yīng)，生成的深色化合物(如類黑色素和美拉德產(chǎn)物)有助于提高其溶解度，改變其組成與結(jié)構(gòu)特性，從而增強(qiáng)穩(wěn)定性、提高藥效并降低毒性。然而，這些微觀結(jié)構(gòu)如何在提高生物利用度方面發(fā)揮作用的機(jī)制，仍需要進(jìn)一步的系統(tǒng)研究。
圖1. DHNPs的形成及其提升多酚生物利用度的示意圖。
這一研究以紅果寶山楂紅素為研究對象，圍繞“炮制誘導(dǎo)—結(jié)構(gòu)組裝—多酚緩釋—促進(jìn)吸收”幾個(gè)環(huán)節(jié)展開討論。
以傳統(tǒng)炮制工藝處理山楂，結(jié)合離心、超濾和凍干等步驟獲得DHNPs，通過粒徑、形態(tài)和成分表征得知DHNPs是以果膠類多糖(主要為HG型果膠)和多酚為主體的球形納米結(jié)構(gòu)，通過皂化水解結(jié)合代謝組學(xué)分析證實(shí)其高量負(fù)載多酚類化合物(~25% wt.)。體外模擬釋放結(jié)合釋放動(dòng)力學(xué)模型表明DHNPs負(fù)載的多酚具有緩釋特性，其釋放過程符合一級(jí)和Korsmeyer-Peppas動(dòng)力學(xué)模型。在Caco-2單層細(xì)胞模型中，DHNPs負(fù)載多酚的細(xì)胞吸收率為游離多酚近兩倍，并基于特異性胞吞抑制劑初步探明DHNPs可通過巨胞飲和Caveolin介導(dǎo)的內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞，增強(qiáng)腸道細(xì)胞對多酚類化合物的攝取，表面食藥同源納米顆?？勺鳛樵鰪?qiáng)活性成分吸收利用的潛在途徑。 注：山楂紅素樣品由紅果寶公司按統(tǒng)一性標(biāo)準(zhǔn)制備。
圖2. DHNPs的粒徑分布、Zeta電位、多分散性指數(shù)(PDI)和微觀形態(tài)。
研究團(tuán)隊(duì)使用激光粒度分析儀(Zetasizer Nano ZS90)測得DHNPs的粒徑主要集中于100–1000 nm范圍內(nèi)，呈中等聚集特征。小于100 nm和大于1000 nm的粒子分別占13.88%和24.98%，提示樣品中既包含部分較小的單體粒子，也存在一定比例的較大聚集體。Zeta電位為-5.44 ± 0.16 mV，表明通過超濾法分離的納米粒子表面帶有輕微的負(fù)電荷，具有一定的膠體穩(wěn)定性。通過透射電子顯微鏡(TEM)觀察了DHNPs的微觀結(jié)構(gòu)，圖像顯示DHNPs主要呈近似球形形貌，輪廓清晰，尺寸分布較為均一;部分粒子呈現(xiàn)分散狀態(tài)，未見融合，表明其具備較好的物理獨(dú)立性。此外，可觀察到部分區(qū)域存在由多個(gè)顆粒有序排列形成的聚集結(jié)構(gòu)，呈現(xiàn)一定的三維堆積態(tài)，同時(shí)發(fā)現(xiàn)這些結(jié)構(gòu)可在超聲處理后恢復(fù)為單分散粒子，這可能反映出顆粒間存在一定程度的結(jié)晶性趨勢。
表1. DHNPs的化學(xué)成分測定。
研究團(tuán)隊(duì)為了分析DHNPs的化學(xué)成分，通過化學(xué)法測定了蛋白質(zhì)、總糖、還原糖、總酚類、黃酮類、總酸、游離氨基酸和類黑精的濃度(表1)。結(jié)果顯示DHNPs的主要成分為多糖和多酚。值得注意的是，化合物成分總含量超過了100%，表明這些成分并非以獨(dú)立形式存在，而是作為復(fù)合物存在。此外，DHNPs中的酚類化合物占比近25%，顯示其作為多酚納米遞送體系的潛力。
表2. DHNPs果膠的甲氧基含量、分子量和單糖組成測定。
研究團(tuán)隊(duì)對DHNPs果膠的主要單糖進(jìn)行了分析(表2)。結(jié)果顯示，DHNPs果膠主要由HG型和RG-I型果膠組成，含量占比分別為74.2%和10.6%。HG完全由半乳糖醛酸殘基構(gòu)成，而對于RG-I，(Ara + Gal)/Rha可作為側(cè)鏈長度和結(jié)構(gòu)復(fù)雜度的指標(biāo)，其比值為4.81，表明DHNPs的RG-I型果膠側(cè)鏈較短，分支較少，這使其整體結(jié)構(gòu)更接近HG型果膠。結(jié)果顯示DHNPs在多項(xiàng)抗氧化能力測試(FRAP、ABTS、DPPH、ORAC)中表現(xiàn)出遠(yuǎn)高于常見新鮮水果的自由基清除能力。提示DHNPs在熱加工過程中形成的納米結(jié)構(gòu)可能通過與多糖的相互作用，穩(wěn)定并保護(hù)多酚類化合物，減少其降解，從而增強(qiáng)其抗氧化能力。
圖3-4. 皂化處理促進(jìn)了多酚的釋放并通過代謝組學(xué)分析揭示了多酚的種類。(a) DHNPs皂化前后多酚含量。BS：皂化前;AS：皂化后。‘*’表示顯著差異，p < 0.05;(b) DHNPs中多酚化合物的組成;(c) 比較皂化前后多酚組成的火山圖;(d) 通過皂化作用切斷DHNPs中多酚與多糖之間酯鍵的示意圖;(e) DHNPs中主要典型酚類化合物的二級(jí)質(zhì)譜圖。
研究團(tuán)隊(duì)為了探究DHNPs中多酚的存在形式，通過皂化水解結(jié)合代謝組學(xué)方法對其進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，多酚濃度在皂化后增加近一倍(圖3a)，表明超過一半的多酚以共價(jià)結(jié)合的形式存在于DHNPs中。提示皂化前檢測到的多酚主要通過氫鍵、疏水作用等弱相互作用吸附在DHNPs表面，而皂化后釋放的結(jié)合型多酚則通過酯鍵與多糖連接存在于DHNPs內(nèi)部。UPLC-QTOF-MS/MS共鑒定出252種生物活性植物化合物，其中酚類化合物(包括黃酮類)占總成分的35%以上(圖3b)?；鹕綀D(圖3c)展示皂化前后多酚化合物組成的變化，顯示大多數(shù)酚類化合物在皂化后含量增加，包括咖啡酸、金絲桃苷、(-)兒茶素、2，5-二羥基苯甲酸、反式阿魏酸等。皂化反應(yīng)破壞了DHNPs基質(zhì)與多酚之間的酯鍵及其他共價(jià)鍵(圖3d)，導(dǎo)致眾多酚類化合物釋放，進(jìn)一步證實(shí)了DHNPs中共價(jià)結(jié)合多酚的存在。
圖5. 游離多酚、DHNPs及DHNPs/游離多酚物理混合物的XRD光譜。
研究團(tuán)隊(duì)為了驗(yàn)證DHNPs中多酚的存在狀態(tài)，采用XRD分析了純咖啡酸、DHNPs以及咖啡酸與DHNPs的簡單物理混合物的結(jié)晶度。結(jié)果表明，純咖啡酸的XRD圖譜在2θ范圍5-30°內(nèi)呈現(xiàn)出多個(gè)特征性窄峰，表現(xiàn)出較高的結(jié)晶度。其與DHNPs的簡單物理混合仍顯示咖啡酸的特征峰，盡管強(qiáng)度有所降低。而對于DHNPs本身的XRD圖譜，則未觀察到明顯的特征性衍射峰，表明DHNPs負(fù)載的多酚以無定形(非結(jié)晶)狀態(tài)存在，DHNPs的結(jié)構(gòu)改變了其內(nèi)部多酚結(jié)晶狀態(tài)。
圖6. DHNPs負(fù)載多酚的緩釋特性及釋放動(dòng)力學(xué)機(jī)制。
研究團(tuán)隊(duì)為了評估DHNPs負(fù)載多酚的釋放特性，進(jìn)行了體外膜透析實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示(圖6a)，游離咖啡酸的釋放率在0–2小時(shí)內(nèi)爆發(fā)增長，超過85%， 24小時(shí)的累積釋放率達(dá)92.6%。相比之下，DHNPs負(fù)載的咖啡酸的釋放速率明顯低于游離咖啡酸，4小時(shí)的累積釋放率僅為50%，24小時(shí)的釋放率為71.2%。這些結(jié)果表明DHNPs具有多酚緩釋特性。為了進(jìn)一步闡明釋放機(jī)制，采用零級(jí)(Zero-order)、一級(jí)(First-order)、Higuchi和Korsmeyer-Peppas動(dòng)力學(xué)模型進(jìn)行擬合分析(圖6b-c)。結(jié)果表明，雖然游離咖啡酸和DHNPs的釋放行為都高度符合一級(jí)動(dòng)力學(xué)模型(釋放速率與未釋放物質(zhì)的剩余量成正比)，但是游離咖啡酸的K1值為1.578，顯著高于DHNPs負(fù)載的咖啡酸(0.462)。這一差異主要?dú)w因于DHNPs與咖啡酸之間的物理包埋和化學(xué)鍵作用，多糖基質(zhì)形成的納米顆粒結(jié)構(gòu)可能充當(dāng)擴(kuò)散屏障，并與大部分咖啡酸共價(jià)結(jié)合，降低咖啡酸從載體中的釋放速率。另外，從釋放曲線的分析來看，這種降低主要體現(xiàn)在初始爆發(fā)式釋放階段，即表面吸附的咖啡酸快速釋放，而內(nèi)部結(jié)合的咖啡酸擴(kuò)散逐漸占主導(dǎo)地位，從而實(shí)現(xiàn)緩釋效果。
圖7. DHNPs提升細(xì)胞活力及其促進(jìn)多酚生物利用度的機(jī)制。(a) DHNPs對Caco-2細(xì)胞活力的影響;(b) 樣品在Caco-2單層透過模型中的透過率;(c) 咖啡酸在Caco-2單層細(xì)胞中的攝取模型;(d) 處理內(nèi)吞作用抑制劑后細(xì)胞對咖啡酸攝取的變化。
研究團(tuán)隊(duì)通過Caco-2細(xì)胞模型評估了DHNPs的細(xì)胞毒性及其負(fù)載多酚的細(xì)胞透過率。細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示(圖7a)，在50–2000 μg/mL的濃度范圍內(nèi)，DHNPs對細(xì)胞無毒性作用，并在100、500和1000 μg/mL濃度下顯著增加了細(xì)胞活力(p < 0.05)，以1000 μg/mL濃度最為明顯。Caco-2單層細(xì)胞滲透性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示(圖7b)，DHNPs負(fù)載咖啡酸的透過率為27.90%，顯著高于游離咖啡酸(p < 0.05)，表明DHNPs的結(jié)構(gòu)有助于咖啡酸跨越Caco-2單層細(xì)胞而增強(qiáng)吸收。為了進(jìn)一步探究DHNPs的運(yùn)輸機(jī)制，研究團(tuán)隊(duì)使用Wortmannin、Nystatin兩種內(nèi)吞抑制劑處理細(xì)胞，結(jié)果顯示DHNPs負(fù)載咖啡酸的透過率均出現(xiàn)顯著下降(p < 0.05)，而游離咖啡酸在抑制劑處理前后無明顯變化，這表明DHNPs進(jìn)入細(xì)胞的方式并非游離多酚的擴(kuò)散相關(guān)途徑，其跨細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)依賴巨胞飲和caveolin介導(dǎo)的內(nèi)吞機(jī)制。
總結(jié)
這一研究在傳統(tǒng)中藥炮制理論與現(xiàn)代納米科技之間架起了橋梁，系統(tǒng)揭示了山楂在“炮制”過程中自發(fā)形成的多酚基納米顆粒(DHNPs)，在提升多酚生物利用度方面的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)與作用機(jī)制，構(gòu)建了“結(jié)構(gòu)—功能耦合”的遞送新模型。其核心包括：
結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)：DHNPs主要由多酚與果膠類多糖(以HG型果膠為主)共組裝形成粒徑約275.7 nm的納米顆粒，兩者通過共價(jià)與非共價(jià)方式緊密復(fù)合，構(gòu)建出穩(wěn)定包埋活性成分并具備可控釋放能力的納米結(jié)構(gòu)。
緩釋特性：DHNPs展現(xiàn)出良好的緩釋性能，其負(fù)載多酚的釋放行為高度符合一級(jí)動(dòng)力學(xué)模型和Korsmeyer-Peppas動(dòng)力學(xué)模型，實(shí)現(xiàn)持續(xù)、穩(wěn)定釋放。
提高生物利用度：DHNPs負(fù)載咖啡酸在Caco-2單層細(xì)胞模型中的吸收率達(dá)到27.90%，是游離態(tài)的兩倍以上。特異性胞吞抑制實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步確認(rèn)其吸收過程依賴巨胞飲和Caveolin介導(dǎo)的主動(dòng)內(nèi)吞機(jī)制，增強(qiáng)腸道細(xì)胞對多酚類化合物的攝取。
總之，DHNPs兼具良好的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性、緩釋能力和細(xì)胞吸收促進(jìn)作用，展現(xiàn)出作為天然、綠色、無需修飾的植物源遞送系統(tǒng)的廣闊應(yīng)用前景。這一研究為利用天然多糖構(gòu)建遞送載體、提升多酚生物利用度提供了新思路，也為草藥基功能性食品的開發(fā)和中藥活性成分的精準(zhǔn)輸送提供了應(yīng)用案例。
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